东方时讯网莱斯大学的合成生物学家表示，他们已经开发出第一种方法来观察细菌中一些最常见的信号处理回路的实时活动，包括利用这些回路增加毒力并产生抗生素耐药性的致命病原体.
双组分系统是细菌用来对周围环境做出反应并生存的感觉回路。莱斯大学生物工程教授JeffreyTabor博士说，细菌使用也称为信号转导通路的电路来感知从光和金属离子到pH值的“无与伦比的刺激范围”，甚至是来自他们的朋友和邻居的信息。
Tabor和博士后研究员RyanButcher用于观察双组分系统中实时磷酸化反应的新光学工具在题为“实时检测活细菌中反应调节剂磷酸化动力学”的研究中有所描述，并发表在PNAS上。
“细菌利用双组分系统(TCS)信号转导途径来感知和适应不断变化的环境。在典型的TCS中，刺激诱导传感器组氨酸激酶(SHK)磷酸化反应调节剂(RR)，然后二聚化并激活转录反应。在这里，我们证明融合的mNeonGreen荧光蛋白探针对激发光的寡聚化依赖性去偏振能够实时监测活细菌中的RR二聚化动力学，”研究人员写道。
“使用诱导型启动子独立表达SHKs和RRs，我们在几个模型途径中检测到刺激添加后几秒内的RR二聚化。我们继续将实验与数学模型相结合，揭示TCS磷酸信号传导随着SHK表达而加速，但随着RR表达和SHK磷酸酶活性而减速。当相应的TCS从诱导系统和天然染色体操纵子表达时，我们进一步观察到SHKNarX响应细胞外电子受体硝酸盐的添加和耗尽的脉冲激活。最后，我们将我们的方法与偏振光显微镜相结合，以在不断变化的刺激条件下实现RR二聚化的单细胞测量。
“RR寡聚化动力学的直接体内表征应该能够深入了解细菌生理学的调节。”
“细菌使用双组分系统来激活毒力和抗生素耐药性，在人类和植物宿主中定殖，形成生物膜和污染医疗设备，”生物工程和生物科学教授塔博尔说。他的实验室多年来一直研究双组分系统。2019年，他的团队推出了一个生物黑客工具包，合成生物学家可以使用该工具包来混合和匹配来自电路的数万个感官输入和基因输出。
该工具包最重要的用途之一是解开双组件系统的双重谜团。顾名思义，这些电路有两个功能：感知细胞外的刺激并改变细胞响应该刺激的行为。
级联反应的第一步是磷酸化，它会激活系统的第二个组成部分，即响应调节器。
尽管磷酸化反应是细菌中数以万计的双组分系统的关键，但很难在活细菌中直接观察到它们。这部分是因为反应调节器通常必须联合起来形成对来进行导致刺激反应的生物级联。
“磷酸化的实验分析通常需要从细菌中纯化蛋白质，并使用凝胶电泳等费力的体外方法进行分析，”Butcher指出。
Butcher创建了一种更简单的方法，该方法依赖于荧光蛋白标签和偏振荧光。他设计了大肠杆菌菌株以产生mNeonGreen荧光蛋白探针，该探针可使激发激光发出的光去偏振，但前提是它们成对相互作用。在多项测试中，Butcher和Tabor表明他们的方法可用于监测各种环境条件下响应调节器激活的幅度和速度。
该方法称为“同型荧光共振能量转移”，简称同型FRET。Tabor说，研究人员可以使用它来跟踪双组分系统的激活，其时间分辨率比以前高得多。
在这项研究中，他和Butcher通过观察硝酸盐激活的双组分系统证明了homo-FRET的效用，该系统已知在大肠杆菌、沙门氏菌和其他病原体的胃肠道定植中发挥作用。
“一段时间以来，微生物学家已经知道许多病原体都使用这种遗传回路，但我们仍然不完全了解它是如何工作的，”Tabor说。
使用他们的方法，Tabor和Butcher在电路中发现了一个以前未报告的活动脉冲，以响应添加硝酸盐。脉冲似乎是由于双组分系统的快速激活，随后细菌消耗硝酸盐和相应的失活而产生的。
“这是了解该电路如何工作的一个窗口，使用以前的方法很难确定这种情况，”Tabor解释道。“通过homo-FRET，我们可以观察电路对正在发生的硝酸盐水平变化的反应。
“我们认为homo-FRET可用于设计生物传感器，其响应速度比当前替代品快10倍，我们和其他人将能够使用它在一系列其他细菌途径中做出新发现。”