新型软CRISPR切口系统简单高效且安全

在果蝇中开发的一种新的基因组编辑系统，使用同源染色体的完整序列对双链断裂(DSB)和单链断裂(SSB)进行有效的体细胞修复。作者将使用切口酶的过程称为同源染色体模板修复(HTR)。

体细胞中DSB的修复，通常是通过容易出错的非同源末端连接来完成的。切口酶(相对于Cas9)引起的修复表型被描述为根据发育时间(分别为晚期与早期)和不良诱变事件的产生(罕见与频繁)来区分。

作者指出，切口酶介导的HTR代表了“一种有效且意想不到的等位基因校正机制，在基因编辑领域具有深远的潜在应用。”

在许多情况下，患有遗传性疾病的人在两个基因拷贝中携带不同的突变。因此，一条染色体上的突变将在另一条染色体上具有功能序列。研究人员利用CRISPR基因编辑工具来利用这一事实。

加州大学圣克鲁斯分校EthanBier实验室的项目科学家AnnabelGuichard博士说：“细胞的修复机制可以利用健康的变体来纠正突变DNA后的缺陷突变。”“值得注意的是，通过一个简单的无害的切口可以更有效地实现这一点。”

研究人员使用眼睛颜色突变体来可视化同源染色体模板修复(HTR)。这些突变体最初的特征是全白眼睛。但当同样的果蝇表达引导RNA和Cas9时，它们的眼睛上会出现大的红色斑块，这表明细胞的DNA修复机制已经成功地利用另一条染色体的功能性DNA逆转了突变。

然后他们用切口酶测试了他们的新系统，切口酶在一条DNA链而不是两条DNA链上都产生切口。尼克斯还对红眼颜色进行了高水平的恢复，几乎与野生型果蝇相当。他们发现，白色基因座处的HTR介导的等位基因转化对Cas9衍生切口酶D10A或H840A诱导的SSB的响应效率比对完全活性Cas9诱导的DSB的响应效率更高(20-30%)。

加州大学圣地亚哥分校比尔实验室的博士后SitaraRoy博士说：“我简直不敢相信切口酶的作用如此之好，这完全出乎我的意料。”研究人员指出，新系统的多功能性可以作为修复哺乳动物基因突变的模型。

“我们还不知道这个过程将如何转化为人类细胞，以及我们是否可以将其应用于任何基因，”吉查德说。“可能需要进行一些调整才能针对人类染色体携带的致病突变获得有效的HTR。”

这项新研究扩展了该小组之前在“等位基因驱动”精确编辑方面取得的成就，“等位基因驱动”扩展了基因驱动的原理，引导CRISPR系统切割不需要的基因变体，并用首选版本替换它们的基因。

该团队研究的一个关键特点是，与传统的基于Cas9的CRISPR编辑相比，他们的基于切口酶的系统引起的靶标和脱靶突变要少得多。他们还指出，在几天内缓慢、连续地递送切口酶成分可能比一次性递送更有益。

“这种方法的另一个显着优点是它的简单性，”加州大学圣地亚哥分校细胞和发育生物学教授EthanBier博士说。“它依赖的组件很少，而且DNA切口是‘软’的，与Cas9不同，Cas9会产生通常伴随着突变的完整DNA断裂。”

Roy指出：“如果可以通过促进同源间配对或通过优化切口特异性修复过程来增加此类事件的频率，那么可以利用此类策略来纠正许多显性或跨杂合的致病突变。”